Репродукция животных
2025-06-06 17:00

Полиморфизмгенов FSHR и INHBA у собак различных пород

Полиморфизм генов FSHR и INHBA у собак различных пород

Богданова С.С. 1, Крутикова А.А. 1, Никиткина Е.В. 1, Рябова А.Е. 1, Мусидрай А.А. 2, Племяшов К.В. 3, Волков К.С. 4, Анипченко П.С. 5

1. Всероссийский научно-исследовательский институт генетики и разведен иясельскохозяйственных животных – филиал Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Федеральный исследовательский центр животноводства – ВИЖ имени академика Л. К. Эрнста» 2. ФГБУН «Санкт-Петербургский Федеральный исследовательский центр РАН» 3. ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургский государственный университ етветеринарной медицины» 4. ООО «ВКС» 5. Университет Перуджи
РЕФЕРАТ

По мере увеличения объема данных о геномных вариациях, инструменты, способные оценить функциональное влияние отдельных нуклеотидных последовательностей, становятся все более актуальными. Существует несколько серверов прогнозирования, доступных для интерпретации влияния вариантов в геноме человека, но немногие из них были разработаны для других видов, и ни один из них не был специально разработан для видов, представляющих интерес для ветеринарии, таких как собаки. [1] Рецепторы гликопептидных гормонов млекопитающих являются ключевыми регуляторами репродуктивного развития, и их гомологи широко распространены в животном мире. [2] Интерес нашей научной группы направлен на поиск генных вариаций перспективных для дальнейших исследований ассоциаций в области репродуктологии собак. В связи с этим была выбрана группа генов, потенциально влияющих на качество спермы кобелей. На основании базы данных генов человека GeneCards® были выбраны следующие гены: ген INHBA (Inhibin subunit Beta A), связанный с активацией и ингибированием фолликулостимулирующего гормона гипофизом, кодируемый этим геном белок играет важную роль в развитии глаз, зубов и яичек [11], а также ген FSHR (follicle stimulating hormone receptor), белок, кодируемый этим геном, относится к семейству 1 рецепторов, связанных с G-белком. Он является рецептором фолликулостимулирующего гормона и участвует в развитии половых желез [11] . Мутации в этом гене вызывают дисгенезию яичников 1-го типа, а также синдром гиперстимуляции яичников у людей [11]. Нами была выдвинута гипотеза, что гены INHBA и FSHR могут влиять на качествоэякулята у кобелей. Исследования в области полиморфизмов генов INHBA и FSHR которые вошли в данное исследование, были проведены ранее на овцах [3] и быках [4].

Ключевые слова: геном; собаки; полиморфизм генов; INHBA и FSHR; эякулят кобелей, SNP.

ВВЕДЕНИЕ

Развитие ветеринарной репродуктологии позволяет использовать новые инструменты для анализа фертильного потенциала производителей. В настоящее время достаточно широко изучены показатели качества эякулята у собак [5], влияние эндокринной системы на показатели качества спермы [6], а также инструменты коррекции возможных известных инфекционных и неинфекционных патологий [7].

С целью получения новых знаний в области вариативности генетического полиморфизма в генах, потенциально связанных с воспроизводительной функцией собак, нами было собрано 37 эякулятов от 37 кобелей различных пород в возрасте от 1 года до 7 лет. Выделено ДНК фенол-хлороформным методом, с последующим секвенированием некоторых локусов кодирующих участков выбранных генов. В данной публикации мы приведем найденные SNP у кобелей различных пород.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

ДНК выделяли стандартным фенолхлороформным методом с использованием протеиназы К [12] из спермы кобелей. Эякуляты кобелей различных пород n=37 собирались мануальным методом. Перед проведением секвенирования исследуемый участок гена был амплифицирован. Последовательности праймеров, которые использовались для амплификации генов:

1. D-FSHR-9e-F cca-ttg-tgg-gta-gcc-ctc-tg

2. D-FSHR-9e-R gta-ccg-agg-gtg-cct-cta-ct

3. D-FSHR-10e-F tct-ggg-cta-aat-ggc-gtagag

4. D-FSHR-10e-R tgt-att-tgc-cat-tcc-gga-ccc

5. D-INHBA-2e-F: tcg-ccc-gaa-atg-agtgag-tg

6. D-INHBA-2e-R: taa-ccg-gct-ctttcg-gac-tc

При подборе праймеров д ля амплификации исследуемого участка г ена FSHR, INHBA использовалась референсная последовательность генома домашней собаки (Canis familiaris) из международной базы генетических данных NCBI. Подбор праймеров осуществлялся с помощью приложения Primer- BLAST интегрированного в NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/).

Амплификация проводилась на термоциклере С-1000 (BioRad) в реакционной смеси объемом 10 мкл, состоящей из 2 мкл 5х буфера для Taq (с содержанием 15Мм Mg2+), 1,2 мкл смеси dNTP (2,5 мМ), 0,2 мкл каждого из праймеров, 0,2 мкл Taq-полимеразы («Сибэнзим», Новосибирск), а также 0,2 мкл выделенной ДНК и 6 мкл деионизированной воды. После амплификации оценивали качество полученных фрагментов с помощью электрофореза в 2% агарозном геле, а также проводии их ферментативную очистку с помощью набора реагентов Exo-SAP IT (ThermoFisher, USA). Секвенирование амплифицированных фрагментов осуществляли с использованием технологии нанопорового секвенирования на приборе MinION (Oxford Nanopore Technologies, Великобритания). Для приготовления библиотек ДНК применяли набор «Rapid Sequencing Kit. Последовательности прочтений определяли с помощью программы MinKNOW (Oxford Nanopore Technologies, Великобритания). Выравнивание прочтений секвенатора на референсную последовательность осуществляли с помощью программы Minimap2 (v.2.24). Определение вариантов производилось с применением программы longshot (v.1.0.0), минимальное покрытие для SNP составляло 500 прочтений.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Нами были секвенированы 9 и 10 участок экзона гена FSHR. И на субъединицебета А ингибина 2 экзон гена INHBA. Были обнаружены однонуклеотидные полиморфизмы. Такие изменения могут приводить к изменению аминокислотного состава полипептида, что, в свою очередь, может повлечь за собой нарушенияпространственной третичной и четвертичной структур белка, что является критичным для белка-рецептора, в данном случае рецептора фолликулостимулирующего гормона, который взаимодействует с ФСГ по принципу «ключ-замок». Нарушение пространственно-структурного соответствия рецептора и действующего вещества может приводить снижению эффекта работы полового гормона, что в свою очередь значительно повлияет на репродуктивную функцию [8-10].

Данные по частоте встречаемости генотипов и аллелей гена INHBA представлены в таблице 1. При анализе распределения частот генотипов было выявлено сильное смещение в сторону диких генотипов. Особенно это выражено для локуса 10826 (94 % генотипа GG). По локусу 10529 наблюдалась примерно одинаковая частота генотипов CT и TT (17,3 и 13,7% соответственно). В локусе 10529 преобладали аллели С (0,76), а в локусе 10826 аллели G (0,98).
Таблица 1. Частота встречаемости генотипов и аллелей по двум SNP гена INHBA у собак
Данные по частоте встречаемости генотипов и аллелей гена FSHR представлены в таблице 2. Из данных таблицы видно, что почти по всем найденным SNP наблюдается смещение к диким генотипам, частота встречаемости от 96 до 100%. Исключение составил локус 162102, в котором было 40 % дикого генотипа СС, 40% гетерозигот CT и 20% гомозигот ТТ.
Таблица 2. Частота встречаемости генотипов и аллелей по 8 SNP гена FSHR у собак
Несмотря на большое фенотипическое разнообразие собак с разной массой тела (от 3 до 80 кг), разным шерстяным покровом (гладкошерстные и длинношерстные), разного назначения пород (декоративные, компаньоны, сторожевые, охотничьи и служебные) частота диких генотипов всех найденных SNP преобладала. Можно предположить, что это связано с отсутствием отбора по репродуктивным показателям, так как селекция в собаководстве в основном направлена на внешний вид и рабочие качества. Мы планируем продолжить изучение возможных ассоциаций однонуклеотидных замен в найденных SNP генов FSHR и INHBA с перспективными репродуктивными показателями, например, такими как качество и криорезистентность спермы. Выявленные ассоциации в дальнейшем могут быть использованы в селекции линий производителей с генетически устойчивым качеством эякулята и способностью к замораживанию и оплодотворяющей способностью.

ВЫВОДЫ

Нами были описаны новые, не встречавшийся раннее в литературе полиморфизмы в участках генов FSHR и INHBA у собак. Как видно из полученных данных, наблюдается различная частота мутаций в исследуемых генах. В гене FSHR локусах 161722, 162295, 161917 – не было выявлено мутаций у исследованной выборки кобелей, что, возможно, делает неперспективным исследование этих локусов. Дальнейшие исследования будут перспективны с привлечением большего поголовья кобелей и анализе корреляции качественных и количественных показателей эякулятов относительно полученных данных в этом исследовании

ИСТОЧНИКИ

  1. Capriotti E. Fido-SNP: the first webserver for scoring the impact of single nucleotide variants in the dog genome / E. Capriotti, L. Montanucci, G. Profiti, I. Rossi, D. Giannuzzi, L. Aresu, P. Fariselli// Nucleic Acids Res. – 2019. - W136-W141. doi: 10.1093/nar/gkz420
  2. Cho S. The C. elegans glycopeptide hormone receptor ortholog, FSHR-1, regulates
  3. germline differentiation and survival / S. Cho, K. Rogers, D. // Fay . Curr Biol. – 2007. - W203-W212. doi: 10.1016/j.cub.2006.12.027
  4. Zilaitiene B. The impact of FSH receptor polymorphism on time-to-pregnancy: a
  5. cross-sectional single-centre study. / B. Zilaitiene, M. Dirzauskas, R.Verkauskiene// BMC Pregnancy Childbirth. – 2018.- W272 doi: 10.1186/s12884-018-1910-2
  6. Nikitkina E. Search for Associations of FSHR, INHA, INHAB, PRL, TNP2 and SPEF2 Genes Polymorphisms with Semen Quality in Russian Holstein Bulls (Pilot Study) / E. Nikitkina, A. Krutikova, A. Musidray, K. Plemyashov // Animals. –
  7. 2021.- Oct 2;11(10)- W2882. doi: 10.3390/ani11102882
  8. Abah K. Effect of male age on semen quality in domestic animals: potential for
  9. advanced functional and translational research / K. Abah, A. Fontbonne, A.Partyka , W. Nizanski // Vet Res Commun. – 2023.- Sep;47(3) - W1125-W1137. doi: 10.1007/s11259-023-10159-1
  10. Hallberg I. Endocrine and dog factors associated with semen quality / I.Hallberg,
  11. H.Olsson, H.Lau , S.Wallander, A.Snell, D.Bergman, B.Holst // Sci Rep. – 2024.- Jan
  12. 6;14(1)- W718. doi: 10.1038/s41598-024-51242-0
  13. Domrazek K. The Impact of Microorganisms on Canine Semen Quality K.Domrazek, P.Konieczny, M.Majka, M.Czopowicz, P.Jurka // Animals (Basel).
  14. –2024.- Apr 23;14(9)- W1267. doi:10.3390/ani14091267
  15. Bhartiya D. An overview of FSH-FSHR biology and explaining the existingconundrums / D.Bhartiya, H.Patel // Journal of ovarian research. –2021.- 14(1)- W144. doi:10.1186/s13048-021-00880-3
  16. Abeygunawardana D. Effect of LHCGR and FSHR gene polymorphisms on fertility
  17. traits and milk yield of cross-bred dairy cows in Sri Lanka / D. Abeygunawardana,
  18. R. Ranasinghe, S.De Silva, P. Deshapriya,Gamika, J.Rajapakse // Anim Biotechnol.
  19. – 2023.- Nov;34(5)- W1719-W1726. doi:10.1080/10495398.2022.2044346
  20. Sharifiyazdi H. Characterization of polymorphism in the FSH receptor gene and its impact on somereproductive indices in dairy cows / H.Sharifiyazdi, A.Mirzaei, Z. Ghanaatian // Anim Reprod Sci. – 2018.- Jan;188- W45-W50. doi: 10.1016/
  21. j.anireprosci.2017.11.00
  22. GeneCards the human gene database [Электронный ресурс]. — Режим доступа: https://www.genecards.org , свободный — (22.04.2025г)
  23. Выделение ДНК теоретические основы [Электронный ресурс]. — Режим доступа: https://vniigen.ru/wp-content/ uploads/2023/07/%D0%A0%D1%8F%D0% B1%D0%BE%D0%B2%D0%B0-%D0% 90.%D0%95 , свободный — (22.04.2025г)
Публикации