Репродукция животных

Оценка качества спермы северных оленей (Rangifer tarandus) с помощью CASA

Елена Владимировна Никиткина, к.б.н., ведущий научный сотрудник, nikitkinae@mail.ru
Кирилл Владимирович Племяшов, д.в.н., профессор, член+корреспондент РАН, директор, spbvniigen@mail.ru
Анна Алексеевна Крутикова, к.б.н., старший научный сотрудник, anntim2575@mail.ru
Светлана Владимировна Тимофеева, к.б.н., старший научный сотрудник, rayo1@yandex.ru
Геннадий Владимирович Ширяев, к.с.х.н., старший научный сотрудник, GS2027@yandex.ru
Артем Алексеевич Мусидрай, лаборант Всероссийский научноисследовательский институт генетики и разведения сельскохозяйственных животных – филиал ФГБНУ ФНЦ ВИЖ имени Л.К. Эрнста
Василий Викторович Гончаров, к.с.х.н., старший научный сотрудник, wgoncharow@mail.ru
Ольга Константиновна Сергеева, научный сотрудник, ols78@mail.ru Научноисследовательский институт сельского хозяйства и экологии Арктики – филиал ФГБНУ ФКНЦ СО РАН
Высокое качество спермы производителей одно из основных условий хорошей плодовитости самок, поэтому для ее оценки необходимы объективные методы. Компьютерный анализатор изображений при изучении спермы (CASA) позволяет производить автоматический анализ подвижности (общей и прогрессивной), концентрации и морфологии сперматозоидов. В результате анализа качества спермы северных оленей (Rangifer tarandus) выявили высокую изменчивость общей и прогрессивной подвижности от 50 до 91 % и от 33 до 79 % соответственно и концентрации сперматозоидов – от 0,25 до 1,2 млрд/мл, в среднем 0,61±0,12 млрд/мл. Количество клеток с неповрежденными мембранами колебалось от 65 до 85 %. По сравнению с нативной спермой установили резкое снижение общей и прогрессивной подвижности сперматозоидов после замораживания в среднем на 60 %, а в некоторых случаях до полной ее потери. Также отметили уменьшение количества клеток с неповрежденными мембранами в среднем на 30 %. Компьютерный анализ позволяет объективно оценивать качество спермы северных оленей по ряду показателей.
Ключевые слова: сперматозоиды, общая подвижность, прогрессивная подвижность, CASA, мембраны, северные олени, эякулят.
С каждым годом возрастает негатив+ ное влияние техногенных, антропогенных и климатических факторов на окружающую среду Севера, в том числе и на растительность, которая является источником кормов для северных оле+ ней. Все это ведет к уменьшению их численности. Существующие методы разведения этих животных не обеспечивают необходимых темпов сохранения и роста их численности, а также производства оленеводческой продукции [1, 3, 5, 6]. Поэтому для искусственного осеменения необходим отбор и интенсивное использование лучших самцов. Основное значение этого метода заключается, прежде всего, в получении от одного производителя за короткое время громадного числа сперматозоидов [2]. Так, например, спермой одного быка можно осеменить в год 12 – 25 тыс. коров, а спермой одного жеребца за случной сезон – 250 – 300 кобыл. В то же время интенсивность использования производителей в значительной мере зависит от биологической характеристики спермы. Основная функция сперматозоида – доставка генетического материала до яйцеклетки и оплодотворение. Эту функцию обеспечивает способность сперматозоидов к движению. Поэтому основным показателем, определяющим биологическую полноценность спермы, является подвижность сперматозоидов, которую оценивают визуально под микроскопом. В значительной мере данный метод является субъективным. С развитием компьютерных технологий стали возможны исследования движения клеток с определением траектории их перемещения и скорости. Использование программных комплексов для характеристики движения сперматозоидов, определения концентра+ ции, морфологии клеток легло в основу CASA (computer-assisted semen analysis) – компьютерного анализа подвижности сперматозоидов. CASA позволяет преодолеть субъективность интерпретации полученных данных. Цель работы – провести оценку качества спермы северных оленей по подвижности и повреждениям мембран с помощью CASA. Материалы и методы. В опытах использовали сперму от 11 самцов северных оленей (Rangifer tarandus), обитающих на полуострове Таймыр, в частном зоопарке Санкт+Петербурга и на экспериментальной ферме Кутухарью (Финляндия), в период гона. Методом электроэякуляции (эякулятор Mini+ tube®) всего было получено 36 эякулятов спермы. Общую и прогрессивную подвижность и концентрацию сперматозоидов оценивали в камере Маклера при 37 0 С. Поврежденность плазматических мембран сперматозоидов жеребцов оценивали с помощью красителя Sperm VitalStain (Nidacon International AB, Швеция). Окрашивание проводили в пробирках типа Eppendorf (20 мкл спер+ мы смешивали с 20 мкл красителя) и делали мазки на предметных стеклах. Препараты просматривали при увеличении 400 (объектив), подсчитывая не менее 200 клеток в каждом образце (белые клетки – неповрежденные; красные или розовые – сперматозоиды с поврежденными мембранами). При микроскопировании применяли Систему анализа изображений Аргус-CASA и микроскоп Motic BA410. Данные обрабатывали с помощью программ SigmaPlot 12.5 (Systat Softwa+ re Inc., США) и Microsoft Excel. Выполняли общий статистический анализ. В статье приведены значения средних величин (Х) и стандартной ошибки среднего (χ).

Результаты исследований и обсуждение.
По подвижности сперма+ тозоиды условно делят на 3 группы: неподвижные; с колебательным или манежным движением; активным поступательным или прогрессивным движением.
Сперматозоиды северного оленя
Рис. 1. Запись траектории движения сперматозоидов северного оленя
С помощью CASA можно объективно оценить общую и прогрессивную подвижность сперматозоидов. В программе разным цветом записываются траектории движения сперматозоидов и скорость (рис. 1). Анализ 36 эякулятов показал, что объем спермы северного оленя колебался от 0,02 до 2 мл (в среднем 0,6±0,11 мл), концентрация клеток – от 0,25 до 1,2 млрд/мл (в среднем 0,61±0,12 млрд/мл), а рН спермы – от 6,7 до 7,2. Общая и прогрессивная подвижность сперматозоидов также варьировали от 50 до 91 % (в среднем 73,3±2,86 %) и от 33 до 79 % (в среднем 63,2±3,44 %) соответственно.
Мазок спермы северных оленей
Рис. 2. Окрашенный мазок спермы северных оленей
Необходимым условием для функционирования клеток является целостность плазменной мембраны. Описывая повреждения сперматозоидов во время замораживания+оттаивания, многие авторы предполагали, что потеря целостности мембраны один из главных факторов снижения их функционирования. Компьютерный анализатор изображений и использование красителя Sperm VitalStain при изучении спермы позволяют производить автоматический анализ сперматозоидов в окрашенном мазке (рис. 2). Количество клеток с неповрежденными мембранами в свежеполученной сперме северных оленей было 79,6±2,3 % (с колебаниями от 65 до 85 %), после замораживания+оттаивания численность их уменьшилась до 47,2±1,16 % (39,5 – 58,2 %). Общая и прогрессивная подвижность сперматозоидов после замораживания была от 0 до 45 % (в среднем 15,4±3,85 %) и от 0 до 32 % (в среднем 11,8±2,83 %) соответственно. Существенное снижение данных показателей, скорее всего, связано с неэффективностью выбранного разбавителя для замораживания спермы северных оленей или самого режима. Заключение. Наблюдавшаяся в данном эксперименте высокая изменчивость общей и прогрессивной подвижности и концентрации сперматозоидов северных оленей согласуется с полученными ранее результатами [1, 4, 7, 8]. Компьютерный анализ спермы позволяет объективно оценивать качество спермы северных оленей по ряду показателей. Работа выполнена при финансовой поддержке Российского Научного Фонда, проект № 171601023.

ЛИТЕРАТУРА
1. Гончаров В.В., Никиткина Е.В. К вопросу об искусственном осеменении и криоконсервации спермы северных оленей. Генетика и разведение животных. 2016; 2:3 – 7.
2. Завертяев Б.П., Ялуга В.Л., Никиткина Е.В. Биотехнологическое использование потенциала половых клеток в воспроизводстве и селекции крупного рогатого скота. Сборник научных трудов: Селекционно+генетические методы повышения продуктивности сельскохозяйственных животных. 1999; 91 – 100.
3. Лайшев К.А., Самандас А.М., Прокудин А.В., Романенко Т.М., Гончаров В.В., Мухамадеева Т.В. Ветеринарные и зоотехнические проблемы вос+ производства в северном оленеводстве и пути их решения. Достижения науки и техники АПК. 2013; 11:42 – 44.
4. Мкртчан М.Е., Деряженцев В.И. К вопросу о взятии семени у хоров методом электроэякуляции. Сборник научных работ Мурманской оленеводческой опытной станции. 1973; 2:31 – 33.
5. Никиткина Е.В., Гончаров В.В., Крутикова А.А., Сергеева О.К., Мусидрай А.А., Племяшов К.В. Репродуктивные технологии в оленеводстве: проблемы и перспективы использования (обзор). Генетика и разведение животных. 2017; 1:9 – 14.
6. Никиткина Е.В., Крутикова А.А., Тимофеева С.В., Ширяев Г.В., Мусидрай А.А., Гончаров В.В., Племяшов К.В. Влияние криоконсервации на подвижность и морфологию сперматозоидов северных оленей (Rangifer tarandus). TERRAАРКТИКА+2018, 2018; 68, 69.
7. Dott H.M. The collection and examination of semen of the reindeer (Rangifer tarandus). Utsi J. Zool Lond. 1971; 164:419 – 424.
8. Plemyashov K., Nikitkina E., Goncharov V., Kru+ tikova A., Sergeeva O. Semen collection and evalua+ tion in reindeer (Rangifer tarandus). Reproduction in domestic animals. 2017; 52(3):178.
Assessment of the sperm quality in reindeer (Rangifer tarandus) by CASA
E.V. Nikitkina, K.V. Plemyashov, A.A. Krutikova, S.V. Temofeeva, G.V. Shiryaev, A.A. Musidray Russian Research Institute of Farm Animal Genetics and Breeding – Branch of the L.K. Ernst Federal Science Center for Animal Husbandry V.V. Goncharov, O.K. Sergeeva Institution of Research Institute of Agriculture and Ecology of the Arctic – Branch of the Federal Research Center "Krasnoyarsk Science Center" High quality of sperm is one of the main reasons for the good fertility in females. Objective methods of sperm evaluation are needed. Computer assisted semen analysis (CASA) allows automatic analysis of motility (total and progressive), concentration and morphology of spermatozoa. As a result a high variability of total and progressive motility in reindeer sperm was obtained – from 50 to 91 % and from 33 to 79 %, respectively, and in the concentration of spermatozoa – from 0,25 to 1,2 billion / ml, an average of 0,61±0,12 billion/ml. The number of cells with intact membranes ranged from 65 to 85 %. A sharp drop in the total and progressive motility after freezing (on average by 60 %, and in some cases to complete loss of motility) was observed. Also, a decrease in the number of cells with intact membranes was found to be 30 % on average. Computer analysis of sperm allows to objectively assess the quality of sperm in rein+ deer.
Key words: spermatozoa, total motility, progressive motility, CASA, membranes, reindeer, ejaculate.
Публикации